Selezneva A.I. 1, Kalatanová A.V. 2, Afonkina O.V. 3
1 kandidát na lekárske vedy, hlavný výskumný pracovník, 2 juniorský výskumný pracovník, 3 juniorský výskumný pracovník, JSC "Petrohradský farmaceutický inštitút"
INTEGROVANÝ PRÍSTUP K ŠTÚDIU FARMAKOLOGICKÝCH LÁTOKIN VITRO, EX VIVO, IN VIVO
anotácia
Článok pojednáva o efektívnom plánovaní a možnostiach uskutočňovania experimentálnych štúdií s využitím optimálneho rozsahu metód na stanovenie možných smerov pôsobenia farmakologických látok.v in vitro, napr in vivo, v in vivo... Konečným cieľom integrovaného použitia súboru metód je získanie spoľahlivých a dostatočných experimentálnych údajov z hľadiska objemu, zníženie objemu, nákladov a času výskumu prostredníctvom kompetentného vývoja výskumného návrhu a použitia údajov získaných v každej fáze.
Kľúčové slová: skríning, predklinické štúdie, lieky, farmakologická látka, účinnosť, bezpečnosť, in vitro, ex vivo, in vivo.
SeleznevaA.I. 1, KalatanovaA.V. 2, Afonkina O.V. 3
1 Kandidat Medical Sciences, vedúci výskumný pracovník, 2 junior vedecký pracovník, 3 junior vedecký pracovník, „Farmaceutický ústav v Petrohrade“
KOMPLEXNÝ PRÍSTUP K ŠTÚDIU FARMAKOLOGICKÝCH LÁTOK VO VITRO, EX VIVO, IN VIVO
Abstrakt
V článku sa uvažuje o efektívnom plánovaní a možnostiach experimentálnych štúdií zahŕňajúcich optimálny rozsah metód na identifikáciu možných oblastí pôsobenia farmakologických látok in vitro, ex vivo, in vivo. Konečným cieľom integrovaného použitia súboru metód je zabezpečiť spoľahlivosť a dostatočnosť experimentálnych údajov, znížiť objem, náklady a načasovanie štúdie príslušným návrhom štúdie a využitím údajov zhromaždených v každej fáze.
Kľúčové slová: skríning, predklinické štúdie, lieky, farmakologické činidlo, účinnosť, bezpečnosť, in vitro, ex vivo, in vivo.
Úspešná štúdia účinnosti a bezpečnosti farmakologických látok priamo závisí od kompetentného plánovania a koncepcie štúdie. Existuje veľké množstvo metód na skríningové aj objemové hodnotenie možného smeru pôsobenia a toxických vlastností farmakologických látok. Tieto metódy možno podmienečne rozdeliť do troch skupín podľa metód ich implementácie - metódy in vitro, ex vivo, in vivo.
Metódy in vitro znamenajú skríning alebo volumetrické hodnotenie účinnosti a bezpečnosti farmakologických látok v modelových systémoch využívajúcich reakčné médiá, enzýmy, bunkové línie atď. Dnes sú metódy in vitro vo svetovej vedeckej komunite veľmi populárne, a to z hľadiska vysokej inovácie a z hľadiska humánneho zaobchádzania so zvieratami. Obmedzujúce štúdie účinnosti a bezpečnosti farmakologických látok metódami in vitro sa však neodporúčajú, pretože extrapolácia získaných výsledkov na celý organizmus sa vyznačuje vysokým rizikom.
Metódy ex vivo sú zvyčajne izolované orgány a tkanivá živých organizmov. Tieto techniky sú tiež všeobecne známe a údaje z ex vivo štúdií majú tendenciu byť klinicky relevantnejšie. Rovnako ako metódy in vitro, výsledky štúdií ex vivo nemôžu byť základom pre začatie klinických skúšok farmakologickej látky.
Metódy in vivo sú klasické pre experimentálnu farmakológiu a sú to štúdie na rôznych druhoch a líniách zvierat. Metódy in vivo umožňujú získanie spoľahlivých a dostatočných výsledkov z hľadiska objemu, ktoré je možné úspešne extrapolovať na kliniku. Existuje veľké množstvo údajov o anatomických, fyziologických, biochemických a iných vlastnostiach druhov a línií pokusných zvierat, ktoré umožňujú stanoviť stupeň relevantnosti pre ľudí a predpovedať výsledky klinických štúdií farmakologických látok. Napriek vysokému obsahu informácií v štúdiách in vivo však môžu najúspešnejší prístup k vývoju koncepcie výskumu poskytnúť výsledky štúdií in vitro a ex vivo. Tieto metódy môžu tiež významne znížiť počet zvierat v experimente, čo má z hľadiska bioetiky kľúčový význam.
Táto práca identifikuje možné možnosti komplexného posúdenia účinnosti farmakologických látok pomocou súboru metód in vitro, ex vivo a in vivo. Použitie integrovaného prístupu umožňuje dosiahnuť, aby bola experimentálna štúdia čo najinformatívnejšia a najspoľahlivejšia.
Komplexné hodnotenie účinnosti farmakologických látokv in vitro, napr in vivo av in vivo
Pre štúdium účinnosti farmakologických látok má osobitný význam skríning farmakologickej aktivity, pilotné štúdie a štúdie mechanizmov účinku. Nové farmakologické látky je teda možné syntetizovať alebo získať z prírodných surovín pomocou rôznych metód; je možné izolovať veľké množstvo stereoizomérov alebo látok, ktoré sa svojou štruktúrou líšia jednou alebo viacerými funkčnými skupinami. Vypracovanie plnohodnotnej štúdie o každom z uchádzačov je časovo náročné, hospodárne a vyžaduje si veľké množstvo zvierat. Použitie metód in vitro a ex vivo vo väčšine prípadov umožňuje výber najsľubnejších kandidátov a zníženie objemu výskumu.
Štúdia in vivo poskytuje volumetrické údaje, ktoré sú optimálne na extrapoláciu na kliniku. Použitie rôznych modelov chorôb u zvierat, ako aj použitie geneticky modifikovaných druhov prispieva k vytvoreniu mechanizmov farmakologického pôsobenia, účinných dávok, dynamiky hodnôt markerov patológie počas dlhodobého používania atď.
Ako príklad uveďme komplexnú štúdiu účinnosti farmakologickej látky X, ktorá má potenciálne antioxidačné a kardioprotektívne vlastnosti, v systéme metód in vitro, ex vivo a in vivo.
Návrh štúdie je uvedený v tabuľke 1.
Tabuľka 1 - Návrh komplexnej štúdie účinnosti farmakologickej látky X
V prvej fáze štúdia mechanizmov účinku in vitro sa zistilo, že farmakologická látka X sa vyznačuje výraznou účinnosťou vo vzťahu k hydroxylovému radikálu a peroxidácii lipidov (tabuľka 2).
Tabuľka 2 - Účinnosť farmakologickej látky X v štúdiách in vitro 
Účinnosť farmakologickej látky X prevyšovala účinnosť referenčného lieku Y.
Zistilo sa, že prítomnosť antioxidačných vlastností farmakologickej látky určuje jej cytoprotektívne vlastnosti. Početné klinické a experimentálne štúdie preukázali, že oxidačný stres hrá kľúčovú úlohu pri rozvoji kardiovaskulárnych patológií, ako je ochorenie koronárnych artérií, hypertenzia, ateroskleróza, koronárna nedostatočnosť a zlyhanie srdca.
Výsledky štúdií in vitro umožnili určiť hlavné smery experimentálneho návrhu ex vivo a in vivo, ako aj ustanoviť možné mechanizmy účinku farmakologickej látky.
Druhou etapou výskumu bolo stanovenie kardioprotektívnych vlastností farmakologickej látky X v experimente ex vivo uskutočňovanom na izolovanom srdci metódou Langendorff. Štúdia sa uskutočňovala s použitím farmakologickej látky X v troch dávkach.
Výsledkom druhej etapy štúdií bolo zistenie, že hodnoty tlaku (LVP) a rýchlosti kontrakcie (dP / dt max) ľavej komory na pozadí ischémie nasledované reperfúziou izolovaného srdca sa štatisticky významne zvyšujú, čo môže naznačovať pozitívny inotropný účinok lieku (obr. 1). ).
Obrázok: 1 - Účinnosť farmakologickej látky X v štúdii ex vivo.
Údaje získané v štúdiách in vitro a ex vivo naznačujú kľúčový mechanizmus účinku a farmakologický účinok látky, a preto je potrebné plánovať experimenty in vivo.
Pretože sa teda farmakologická látka X in vitro a ex vivo vyznačovala výraznou kardioprotektívnou aktivitou, ako aj účinkom na antioxidačný systém, boli vybrané modely kardiovaskulárnych patológií na štúdium špecifickej aktivity in vivo, ktorej patogenéza je spojená s oxidačným stresom a zhoršenou kontraktilitou myokardu. : akútny infarkt myokardu a arteriálna hypertenzia.
Výsledkom štúdií účinnosti farmakologickej látky X in vivo na modeli akútneho infarktu myokardu bol účinok na fyziologické a biochemické parametre modelovanej patológie (tabuľka 3).
Tabuľka 3 - Účinnosť farmakologickej látky X na pozadí modelovania akútneho infarktu myokardu u potkanov, M ± m. 
Ako výsledok štúdií účinnosti farmakologickej látky X in vivo u spontánne hypertenzných potkanov bol pozorovaný výrazný pokles systolického (SBP) a diastolického (DBP) krvného tlaku pred aplikáciou farmakologickej látky X aj 1 hodinu po nej (tabuľka 4).
Tabuľka 4 - Zmena krvného tlaku počas používania farmakologickej látky X 
Poznámka - * p ‹0,05 v porovnaní s kontrolnou skupinou
Výsledkom použitia komplexného hodnotenia in vitro, ex vivo a in vivo bola teda vysoká účinnosť novej farmakologickej látky X a boli stanovené možné mechanizmy účinku. Kardiotonický a kardioprotektívny účinok liečiva bol stanovený na modeli izolovaného srdca metódou Langendorff a na modelovaní akútneho experimentálneho infarktu myokardu in vivo. Pri použití nového liečiva u spontánne hypertenzných zvierat sa pozorovalo pretrvávajúce zníženie krvného tlaku, ako aj pokles počiatočných hodnôt tlaku do konca liečby. Zistilo sa, že kľúčovú úlohu pri uskutočňovaní farmakologických účinkov farmakologickej látky X zohráva jej antioxidačná aktivita, ktorá sa potvrdila v štúdiách antiradikálnej a regeneračnej schopnosti in vitro.
Použitie metód in vitro a ex vivo umožnilo významne znížiť objem pokusných zvierat, pretože na základe ich výsledkov boli vybrané účinné dávky farmakologickej látky X a najvhodnejšie experimentálne modely.
Literatúra
- E. B. Menshchikova Oxidačný stres: Patologické stavy a choroby. - Novosibirsk: ARTA, 2008,284 s;
- Toropova Ya.G. Perfúzia izolovaného srdca metódou Langendorff a Nilly: potenciálne aplikácie vo vedeckom výskume / Ya.G. Toropova, N.Yu. Osyaev, R.A. Mukhamadiyarov // Translačná medicína. - 2014. Č. 4 - S. 34-39.
Referencie
- Russell W.M.S., Burch, R.L. Princípy humánnej experimentálnej techniky. - Londýn: Methuen & Co. 238 strán;
- Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63 / EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely // Úradný vestník Európskej únie. 2010. S. 33-79;
- Humánna veda v 21. storočí: abstrakty z 9. svetového kongresu, Praha, 2014. Zväzok 3, č. 1,336 strán;
- Zhromažďuje J. Antioxidačné a cytoprotektívne reakcie na oxidačno-redukčný stres // Biochem Soc Symp. - zv. 71. - S. 157-176;
- Addabbo F. Mitochondria and Reactive Oxygen Species / F. Addabbo, M. Montagnani, M.S. Goligorsky // Hypertenzia. - 2009.53. - S. 885-892;
- Men'shhikova E.B. Okislitel'nyj stress: Patologicheskie sostojanija i zabolevanija. - Novosibirsk: ARTA, 2008,284 s;
- Toropova Ja.G. Perfuzija izolirovannogo serdca metodom Langendorf i Nilli: vozmozhnosti primenenija v nauchnyh issledovanijah / Ja.G. Toropova, N.Ju. Osjaev, R.A. Muhamadijarov // Transljacionnaja medicina. - 2014. Č. 4 - S. 34-39.
- „v (v) živote“), to znamená „vo vnútri živého organizmu“ alebo „vo vnútri bunky“.
Vo vede in vivo znamená vykonávanie experimentov na (alebo vo vnútri) živého tkaniva so živým organizmom. Toto použitie tohto výrazu vylučuje použitie časti živého organizmu (ako sa to robí pri testoch) in vitro) alebo pomocou mŕtveho organizmu. Testovanie na zvieratách a klinické skúšky sú formou výskumu in vivo.
pozri tiež
| Toto je útržok článku z biológie. Projektu môžete pomôcť pridaním.
Pokiaľ je to možné, táto poznámka by mala byť nahradená presnejšou. |
Napísať recenziu na „In vivo“
Výňatok in vivo
„Nie, teraz to opustia, teraz budú zhrození z toho, čo urobili!“ Pomyslel si Pierre a bezcieľne sledoval davy nosidiel pohybujúcich sa z bojiska.Ale slnko zakryté dymom bolo stále vysoko a spredu, a hlavne zľava blízko Semjonovského, sa niečo v dyme varilo a dunenie výstrelov, streľby a kanonády nielenže neutíchalo, ale zosilňovalo aj zúfalstvo ako človek, ktorý kričí s posledným kúskom sily.
Hlavná akcia bitky pri Borodine sa odohrala v priestore tisícov siah medzi Borodinom a Bagrationovými prívalmi. (Mimo tohto priestoru na jednej strane Rusi predviedli ukážku Uvarovovej kavalérie za pol dňa, na druhej strane za Utitsom došlo k stretu Poniatovského s Tuchkovom; išlo však o dve samostatné a slabé akcie v porovnaní s tým, čo sa stalo uprostred bojiska. ) Na poli medzi Borodinom a návalmi, v blízkosti lesa, na otvorenom a viditeľnom úseku z oboch strán, sa hlavná akcia bitky odohrala najjednoduchším a najgeniálnejším spôsobom.
Výskum sa vykonáva s mikroorganizmami, bunkami alebo biologickými molekulami mimo ich normálneho biologického kontextu. Hovorovo sa nazývajú experimenty in vitro. Tieto štúdie v biológii a jej subdisciplínach sa tradične uskutočňovali v skúmavkách, bankách, Petriho miskách atď. A od začiatku molekulárnej biológie zahŕňali metódy nazývané omics. Štúdie, ktoré využívajú komponenty tela izolované z ich normálneho biologického prostredia, sú podrobnejšie a pohodlnejšie ako analýzy s celými organizmami. Naopak, štúdie in vivo sa uskutočňujú na zvieratách vrátane ľudí a celých rastlín.
Príklady
Príklady štúdií in vitro: izolácia, rast a identifikácia buniek pochádzajúcich z mnohobunkových organizmov (bunková kultúra alebo tkanivová kultúra); subcelulárne zložky (mitochondrie alebo ribozómy); bunkové alebo subcelulárne extrakty (napr. extrakty z pšeničných klíčkov alebo retikulocytov); purifikované molekuly, ako sú proteíny, DNA alebo RNA); a priemyselná výroba antibiotík a farmaceutík. Vírusy, ktoré sa replikujú iba v živých bunkách, sa študujú v laboratóriu na bunkovej alebo tkanivovej kultúre a mnoho zoovirológov túto prácu nazýva in vitro, aby ju odlíšilo od práce in vivo na celých zvieratách.
- Polymerázová reťazová reakcia je metóda selektívnej replikácie špecifických sekvencií DNA a RNA in vitro.
- Purifikácia proteínu je izolácia špecifického proteínu z komplexnej zmesi, ktorá sa v mnohých prípadoch získava z homogenizovaných buniek alebo tkanív.
- Oplodnenie in vitro sa vykonáva v miske pomocou spermií a vajíčka. Oplodnené embryo (embryá) sa potom implantuje do maternice matky.
- In vitro diagnostika predstavuje širokú škálu lekárskych a veterinárnych laboratórnych testov. Sú nevyhnutné na diagnostiku chorôb a sledovanie klinického stavu pacientov a ako materiál slúžia vzorky krvi, buniek alebo iných tkanív pacienta.
Testovanie in vitro sa používa na charakterizáciu špecifickej adsorpcie, distribúcie, metabolizmu a vylučovania (ARME) liekov alebo všeobecných chemikálií v živom organizme. Napríklad experimenty s bunkami Caco-2 pomôžu posúdiť absorpciu zlúčenín cez sliznicu. gastrointestinálny trakt... Môžete definovať zdieľanie spojení medzi orgánmi, aby ste študovali distribučné mechanizmy. Suspenzia alebo kultúra v miske primárnych hepatocytov alebo bunkových línií podobných hepatocytom (HepG2, HepaRG) sa môže použiť na štúdium a vyčíslenie metabolizmus chemikálií. Tieto parametre procesov ARME možno potom integrovať do takzvaných „fyziologických farmakokinetických modelov“ alebo FMFO.
Videá z výskumu in vitro
Výhody in vitro
Štúdie in vitro umožňujú druhovo špecifickú, jednoduchšiu, pohodlnejšiu a podrobnejšiu analýzu ako analýza celého organizmu. Rovnako ako výskum na celých zvieratách čoraz viac nahrádza výskum na ľuďoch, aj výskum in vitro nahrádza výskum na celých zvieratách.
Jednoduchosť
Živé organizmy sa javia ako mimoriadne zložité funkčné systémy tvorené desiatkami tisíc génov, molekúl proteínov a RNA, anorganických iónov malých organických zlúčenín a komplexov. Prostredie, v ktorom sa nachádzajú, je priestorovo usporiadané membránami a za to zodpovedajú mnohobunkové organizmy, orgány a systémy. Tieto nespočetné zložky pôsobia medzi sebou navzájom a s prostredím na spracovanie potravy, odstránenie odpadu, presunutie zložiek na správne miesto a reagujú na signalizačné molekuly, svetlo, iné organizmy, teplo, zvuk, chuť, rovnováhu a dotyk.
Táto zložitosť sťažuje stanovenie vzťahov medzi jednotlivými zložkami, ako aj štúdium základných biologických funkcií. Práca in vitro zjednodušuje testovaný systém, takže sa výskumník môže sústrediť na malý počet komponentov.
Napríklad identifikácia proteínov imunitného systému (napríklad protilátok) a mechanizmus, pomocou ktorého rozpoznávajú a viažu cudzie antigény, by zostali nejasné. Rozšírené použitie in vitro prác však umožnilo izolovať proteíny, identifikovať bunky a gény, ktoré ich produkujú, a skúmať fyzikálne vlastnosti interakcie s antigénmi. Okrem toho bolo možné určiť, ako táto interakcia vedie k bunkovým signálom, ktoré aktivujú ďalšie zložky imunitného systému.
Druhová špecifickosť
Ďalšou výhodou metód in vitro je, že je možné študovať ľudské bunky bez „extrapolácie“ z bunkovej odpovede experimentálneho zvieraťa.
Pohodlie, automatizácia
Metódy in vitro môžu byť miniaturizované a automatizované, čo vedie k vysoko výkonným metódam skríningu na testovanie molekúl v toxikológii alebo farmakológii.
nevýhody
Hlavnou nevýhodou experimentálnych štúdií in vitro je, že je ťažké extrapolovať výsledky späť na biológiu intaktného organizmu. Vyšetrovatelia in vitro musia byť opatrní, aby zabránili nadmernej interpretácii výsledkov. To môže viesť k mylným záverom o biológii tela a systému.
Napríklad vedci podieľajúci sa na vývoji nového vírusového lieku na liečbu infekcie patogénnym vírusom (ako je HIV-1) môžu dospieť k záveru, že potenciálny liek slúži na zabránenie replikácie vírusu in vitro (zvyčajne v bunkovej kultúre). Pred použitím lieku v klinickom prostredí však prejde radom in vivo testov na stanovenie stupňa bezpečnosti a účinnosti u intaktných organizmov (zvyčajne postupne u malých zvierat, primátov a ľudí). Typicky väčšina kandidátskych liekov, ktoré sú účinné in vitro, nie sú účinné in vivo kvôli problémom s dodávaním liečiva do chorých tkanív, toxicite pre kritické časti tela, ktoré sa neodrazili v počiatočných štúdiách in vitro, alebo kvôli iným problémom. ...
Extrapolácia in vitro na in vivo (IVIVE)
Výsledky získané z experimentov in vitro zvyčajne nemožno transformovať tak, aby predpovedali reakciu celého organizmu in vivo. Preto je nesmierne dôležité vyvinúť konzistentný a spoľahlivý postup extrapolácie z výsledkov in vitro na in vivo. Spravidla sa prijali dve rozhodnutia:
- Zvýšená zložitosť systémov in vitro pre reprodukciu tkanív a interakcie medzi nimi (ako v systémoch typu človek-na-čipe).
- Využitie matematického modelovania na numerickú simuláciu správania zložitého systému, kde údaje in vitro poskytujú hodnoty modelových parametrov.
Tieto dva prístupy nie sú nekompatibilné: vylepšené systémy in vitro poskytnú presnejšie údaje pre matematické modely. Na druhej strane čoraz sofistikovanejšie experimenty in vitro zhromažďujú čoraz zložitejšie, náročnejšie a sľubnejšie údaje na integráciu. To je miesto, kde sú potrebné matematické modely, napríklad v systémovej biológii.
Extrapolácia vo farmakológii
Vo farmakológii možno štúdie IVIVE použiť na aproximáciu farmakokinetiky (PK) alebo farmakodynamiky (PD). Pretože čas a intenzita expozície danému cieľu závisia od času koncentrácie priebehu potenciálneho liečiva (príbuznej molekuly alebo metabolitov) v cieľovom mieste, citlivosť tkanív a orgánov in vivo môže byť úplne odlišná alebo dokonca opačná od citlivosti pozorovanej na kultivovaných bunkách in vitro. ... To naznačuje, že účinky extrapolácie pozorované in vitro si vyžadujú kvantitatívny in vivo model PK. Všeobecne sa predpokladá, že fyziologicky založené modely PK (FMFO) hrajú pri extrapolácii ústrednú úlohu.
V prípade skorých účinkov alebo účinkov bez medzibunkovej komunikácie sa predpokladá, že rovnaká koncentrácia bunkovej expozície vyvoláva rovnaké účinky z kvalitatívneho aj kvantitatívneho hľadiska, in vitro a in vivo. V tejto situácii je postačujúce vyvinúť jednoduchý PD model vzťahu dávka-odpoveď pozorovaný in vitro a transponovať bez modifikácie, aby sa predpovedali účinky in vivo.
Načítava ...